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博士三板斧---安全有效使用蛭弧菌防治弧菌病

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发表时间:2019-03-22 00:23


近两年,蛭弧菌产品的使用又突然火了起来,市面上也出现了各式各样的蛭弧菌产品,有液体蛭弧菌,有粉剂蛭弧菌,还有蛭弧菌冻干粉但是同样都是蛭弧菌,有的产品用的很好,有的产品用的却见不到效果,很多养殖户甚至厂家都对蛭弧菌相关产品抱有疑问,本文则希望通过对蛭弧菌知识的初步梳理,为养殖户、经销商、公司更好的理解、使用蛭弧菌产品的使用提供一些思路。

一、到底什么是蛭弧菌?

(一)蛭弧菌发现及命名

蛭弧菌是在1962年由StolpPetzold首次发现于菜豆叶烧病假单胞菌体中,随后从土壤、污水中都分离到了这种细菌。所以蛭弧菌从发现到现在才不过56年的时间。

蛭弧菌命名为Bdellovibriobacteriovorus。其中,Bdello一词来自希腊字,是水蛭的意思,“vibrio”意为弧菌,而种名“bacteriovorus”食细菌的意思。其命名很有意思,水蛭代表了其生理上的一些动作形为,蛭弧菌的捕食生活方式很特殊,它是寄生于其他细菌并能导致其裂解的一类细菌——请注意,是裂解,不是整个吃掉哦。

(二)蛭弧菌的基本情况

蛭弧菌也叫噬菌蛭弧菌,属于细菌界变形细菌门蛭弧菌科蛭弧菌属,具有细菌的一切形态特征:单细胞,弧形或逗点状,有时呈螺旋状。0.3-0.6×0.8-1.2微米,或仅为杆菌长度的1/3-1/4,端生鞭毛,比其他细菌的鞭毛粗3-4倍,与鞭毛相对的一端有钉状纤毛,被称为感染锥子,与菌体的识别和吸附宿主有关。其运动活跃。革兰氏染色阴性。

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有几点要特别说明下

第一、蛭弧菌比通常的细菌要小,能通过细菌滤器,所以普通的显微镜是看不到它的,至少要用到油镜,甚至需要染色才行。

第二、在相差显微镜下,可见蛭弧菌呈跳跃式的运动。电镜观察,蛭弧菌以弧、杆状为主。

第三、就是因为小,所以,低于2万转的离心机对蛭弧菌的浓缩都是没有意义的,而2万转的离心机则一般是实验室才会配备,而且容易小,对实际生产而言,应用还有些距离。

(三)蛭弧菌生活方式及生长要求

蛭弧菌有寄生型,也有兼性寄生,极少数营腐生。非寄生型营腐生生活,可在蛋白胨和酵母提取物培养基上生长繁殖。从自然界分离得到的蛭弧菌都是依赖寄生型,迄今为止,还没有直接从自然界分离得到非寄生型。不依赖宿主的蛭弧菌,只能生活在实验室条件下。

寄生型蛭弧菌生长,一般要求pH6.0-8.5;温度23-37℃,低于12℃,高于42℃时均不生长;能稳定分解蛋白质,一般不利用碳水化合物,而以肽、氨基酸作碳源和能源;能液化明胶;严格好氧。

——所以请注意以下几点:

第一、温度不在适宜范围的时候,蛭弧菌是不生长的,所以使用时要充分考虑这一点。比如34月份用它用泡苗,效果肯定不会好,但如果改成拌料投喂,会对肠道控菌产生积极影响。

第二、蛭弧菌的繁殖是需要氧气的,使用的时候也建议在早上8-10点使用,这样可以获得较为充足的溶氧。另外,其耗氧不会达到非常剧烈的程度,因为其繁殖代时一般要4-6小时。

(四)寄生的特异性问题

蛭弧菌与宿主细胞之间,常表现出一定的特异性。不过,有的特异性较差,能侵入多种细菌。例如不同的蛭弧菌菌株,能侵入各类不同的植物病原菌。

从这一点上看,其比噬菌体(病毒)、细菌素(蛋白质)的广谱性要好。实际上蛭弧菌可感染许多不同科属的菌,但其总体上有一定偏向性,比如其可感染大多数革兰氏阴性细菌(如志贺氏菌属、沙门氏菌属、埃希氏菌属、欧文氏菌属、变形杆菌属、弧菌属、假单胞菌属、钩端螺旋体等微生物),但只对少数的革兰氏阳性(如粪链球菌、乳酸菌等)细菌感兴趣,比如其就不裂解枯草杆菌,同时也有报道指出其对某些真菌和肠道病毒也有一定的裂解活性。

——寄生的特异性也对我们的实际使用方法有很大的影响,即蛭弧菌是不是不管好菌坏菌都会攻击?如果是这样的话,那么很难被我们所用了,但实际上,其有一定倾向性,这就给我们实际的应用提供了更多的可能性。

郭衍彪(2016年)的研究指出,蛭弧菌BDW03对试验组大菱鲆肠道没有控制作用的菌属为8个(占53.3%),这8个菌属中多为革兰氏阳性菌属(6/8)。另外,其通过乳酸菌拌食饵料和泼洒BALOs喂食大菱鲆60d后,乳酸菌和BALOs对大菱鲆肠道菌群中革兰氏阴性菌的控制作用(分别占总菌属的33.3%26.7%)优于对革兰氏阳性菌的控制作用(分别占总菌属的(26.7%20.0%)。这也间接指出了蛭弧菌对细菌的裂解可能有一定的偏向性。

徐琴等人(2009)的研究指出,加噬菌蛭弧菌和黏红酵母组的试验效果不理想,表明这两株菌体之间有一定的拮抗作用。而联合使用噬菌蛭弧菌和球形红假单胞菌(是紫色非硫光合细菌红假单胞菌属的一个种)组展示了净化水质,预防病害的优良前景,此组能有效地吸收氨氮、硫化物等有害物质。这也指出了蛭弧菌是直接可以和某些光合细菌直接混合使用的,这一点大大提高了使用的方便性。

另外,陈家长等人(2003年)曾在螃蟹养殖中,间隔使用光合细菌和蛭弧菌:每20天用噬菌蛭弧菌和光合细菌各1,使用方法为使用光合细菌1 周后使用噬菌蛭弧菌,实验周期 3个月。其中蛭弧菌浓度为107cfu/mL,光合细菌为109cfu/mL。这样间隔使用的效果也非常不错,25d后养殖中华绒螯蟹验组比对照组池塘中的细菌总数少2个数量级,70d 后实验组比对照组池塘中的细菌总数少3个数量级,另外试验池塘的COD、氨氮及硫化物有明显的降低,有效的提高了中华绒螯蟹的成活率,但是本文并没有探讨如何混合使用。

再加上其他专家的一些总结,基本上,蛭弧菌更偏向于革兰氏阴性杆菌,同时从即有的论文得知,其最好不要用酵母混用,但蛭弧菌可以和光合细菌混用,当然,建议最好分开使用。同时还有一个关键点,即在一个20天的周期内,蛭弧菌对水体的调控作用能达到近2周时间。

(五)蛭弧菌为什么用双层平板而不用单层平板法检测?

主要的原因在于培养皿底部并不是十分平整,因此注入少量培养基铺平底部作为下层,会获得几近水平的底部,然后在上面将噬菌体和细菌混合物的培养基(比较薄)注入作为上层,这样使得观察物在同一平面,更利于噬菌斑的观察及分离纯化。

实际上单层平板法与双层平板法所形成的噬菌斑的比较图如下:

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(六)安全性问题

王亚丽(2007年)的研究指出,将分蛭弧菌离株BD5W107pfu/mL浓度给小鼠灌胃,试验组和对照组均健康,证明噬菌蛭弧菌对小鼠没有毒性作用。

林茂等(2010年)的研究也证实了蛭弧菌作为一种微生态制剂的无毒无害特点。

徐懿(2011年)在噬菌蛭弧菌BD57的急性毒性试验研究指出,根据《兽药试验技术规范汇编》的要求选用小白鼠进行了急性毒性试验。分别采用灌胃和腹腔注射法进行了急性毒性试验,试验结果表明,噬菌蛭弧菌BD57 对小鼠没有毒性作用。

陈丽芸(2012年)的研究也指出,至今没有发现蛭弧菌对真核细胞有毒的报道,对小白鼠、豚鼠、家兔等动物无毒性作用,对猴肾、Hela细胞组织培养也未引起细胞病变。迄今为止,相关报道表明蛭弧菌对人和某些动物无毒害作用。

二、蛭弧菌的裂解机制

蛭弧菌对于宿主菌的裂解过程一般分为五个步骤:识别、吸附与侵入、定位与合成、复制、裂解。整体示意如下图:

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1、识别

蛭弧菌的化学趋避运动是其识别宿主菌细胞的重要方式,蛭弧菌识别宿主并非用其化学趋避性直接去识别感染,而是在含有某些氨基酸及化合物的环境中,通过化学趋向性,寻找碳源和能源,以缓和饥饿状态,这样蛭弧菌聚集在宿主菌所需的营养物质周围,而宿主菌也向营养物质接近,使局部环境中的宿主菌浓度升高,因此,增加了蛭弧菌对宿主菌侵染和吸附的机会。

在这个过程中,有趣的是蛭弧菌可以通过鞭毛实现跳跃式的运动,而向宿主菌快速移动,其是通过无鞭毛一端粘附于宿主菌表面的。鞭毛在这里起到了非常重要的作用,实际上,在一些发酵的试验研究过程中也发现,如果发酵罐内的浆叶转速过快,对鞭毛有损伤的话,蛭弧菌就无法再攻击宿主。

2、吸附与侵入

为了实现吸附与侵入这个目的,蛭弧菌菌体会以100/秒以上的速度产生一种机械钻孔效应,加上蛭弧菌入侵时的收缩从而进入宿主菌的周质空间

3、定位与合成

一是蛭弧菌会脱掉鞭毛,二是宿主菌会变成蛭质体。

4、复制

蛭弧菌在这个阶段实现了复制繁殖。蛭弧菌繁殖一代需4~6h,每次可复制6~36 个子代细胞。

5、裂解

在最后一个过程中,蛭弧菌会合成鞭毛,裂解宿主的细胞膜,释放出所有蛭弧菌。

电镜的一些图片如下:

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三、蛭弧菌的保存方式研究

黄文等人(2002年)曾对五种蛭弧菌的保存方法做了对比研究,其指出5种保藏方法中以冷冻干燥法保藏效果最好,21个月的复活率为100%,其次为4℃营养肉汤液保藏法和-20℃甘油保藏法,17个月复活率均为67%

当然,有一点要明确,其冷冻干燥完成之后,是在4℃环境中进行保存的。

另外,邓璐等人(2008年)研究了不同的保护液、保藏温度和保藏载体的选择对蛭弧菌长期保藏的影响,以及对优化保藏条件下的蛭弧菌复苏率和复苏蛭弧菌的噬菌能力检测,并且对保藏期限内宿主菌的存活情况与蛭弧菌的存活情况的相互影响做了首次的报道。结果表明:1/100NB等低营养液体为保护液、琼脂为载体、加入适量宿主菌于4℃,蛭弧菌保存可达2年以上,保存期内蛭弧菌的复苏率和出斑数目较对照组都有极其显著的提高(P<0.01)

目前常温保存的研究还未查到,所以建议蛭弧菌产品最好存放于4℃环境中,实际上普通的立式冷藏冰柜就可以满足这个条件。

四、蛭弧菌的使用方法

蛭弧菌到底在实际中应该如何使用?这必需要结合蛭弧菌本身的特点,同时考虑现实问题,才能真正发挥最大效果。实际的用法建议如下:

特别推荐在所有甲壳类养殖动物(小龙虾、螃蟹、白虾等)脱壳期之前使用,达到无刺激生物消毒这个效果。

1、则脱壳期是这些养殖动物特别脆弱的时期,容易感染相关疾病,尤其是温度升高的时候更是如此;另外,在脱壳期,甲壳类动物特别敏感,很多消毒剂是不能使用的,而蛭弧菌则可以做到安全无刺激;使用上,建议提前2天左右使用,如果能先使用博士超能钙之后再使用噬菌博士和噬菌120那就更好了,因为一定量的钙离子可以促进蛭弧菌的繁殖。

2、推广配合化学消毒剂治疗疑难杂症

到了养殖中后期,在温度高的时候,有些疾病非常难以治疗,主要的特点是止不住、易反复

为了让杀菌即迅速又持久,则必需结合使用博士消毒液、博士精碘化学消毒剂噬菌博士和噬菌120蛭弧产品。首先使用博士消毒液、博士精碘对水底、水面进行综合消毒,必要时结合博士全效底改、分解底改、高效过硫颗粒等化学底改做到水体池底全方位消毒,在见到效果之后使用水博士、VC解毒灵进行水体解毒,再连续使用1-2噬菌博士或噬菌120蛭弧菌产品,就可以看到明显的治疗效果。因为化学消毒剂起到了快速压制的效果,而蛭弧菌则起到了长期压制有害菌的效果,强强联合,能有效的抑制有害菌的繁殖。这同时也符合“博士3板斧”的“化学消毒+有机酸解毒+生物消毒占位”核心原则。

3、建议预防使用,降低发病率

在使用过高效过硫颗粒后,第二天可以大剂量使用有益菌,此时建议使用噬菌博士或噬菌120博士光合菌一起混合使用,这一点已通过试验证明是可行的。

当然也可以按20天一个周期,先行使用光合细菌,一周后再使用蛭弧菌,也能达到比较好的使用效果。

何义进等人(1996年)所做的室外小水体试验结果表明,在使用蛭弧菌的水体中,除DOpH 比较稳定外,其它水质理化指标NH4-NNO2-N、总磷和透明度都或多或少地发生了一些变化。

4、建议拌料防治肠炎

蛭弧菌产品最早是做为兽药在畜禽上推广使用的,在畜禽上大部分是做为治疗肠炎存在,尤其是针对刚出生的小猪小鸡。

那么,在水产上如何推广呢?蛭弧菌其实主要针对大肠杆菌引起的相关肠炎疾病,因为在发酵蛭弧菌之前,必需先行生产大肠杆菌,再将蛭弧菌接种进去,大肠杆菌是蛭弧菌最为喜爱的细菌之一,因此其治疗此类肠炎效果会更好一些。

另外,蛭弧菌本身就是一个宝库,其的蛋白质含量丰富,可达细胞干重的60%~65%DNA的含量为5%